[대한약전/KP] 미생물한도시험 (특정미생물시험)

미생물한도시험 (특정미생물시험)

 

비무균제품의 미생물학적시험 : 특정미생물시험

1) 서문

이 시험은 규정된 조건에서 검출할 수 있는 특정 미생물이 존재하지 않거나 그 존재가 한정적인지를 판정하는 방법이다. 이 시험은 원료나 제제가 이미 정해진 미생물학적품질규격에 적합한지의 여부를 판정하는 것을 주 목적으로 한다. 채취검체수를 포함하여 지시된 방법에 따라 시험하여 결과를 판정한다. 약전시험법과의 동등성이 인정되는 경우에는 자동화법을 포함한 다른 미생물학적 방법을 적용할 수 있다.

II. Microbiological Examination of Non-sterile Products: Tests for Specified Micro-organisms
1) Introduction These tests are harmonized with the European Pharmacopoeia and the U.S. Pharmacopeia.
The tests described hereafter will allow determination of the absence of, or limited occurrence of specified microorganisms which may be detected under the conditions described. The tests are designed primarily to determine whether a substance or preparation complies with an established specification for microbiological quality. When used for such purposes follow the instructions given below, including the number of sample to be taken and interpret the results as stated below. Alternative microbiological procedures, including automated methods may be sued, provided that their equivalence to the Pharmacopoeial method has been demonstrated.

2) 기본조작

검체의 조제는 ｢생균수시험｣에 따른다. 검체가 항균활성이 있을 때에는 ｢생균수시험｣에서와 같이 이 항균활성을 제거 또는 중화한다. 검체의 조제에 계면활성제를 쓸 때에는 ｢생균수시험｣에서와 같이 미생물에 대한 독성이 없고 사용하는 불활성화제와 상호작용이 없는 것을 확인한다.

2) General Procedures The preparation of samples is carried out as described in I. Total viable aerobic count. If the product to be examined has antimicrobial activity, this is insofar as possible removed or neutralized as described in I. Total viable aerobic count. If surfaceactive substances are used for sample preparation, their absence of toxicity for microorganisms and their compatibility with inactivators used must be demonstrated as described in I. Total viable aerobic count. 

 

3) 배지의 성능, 시험법의 적합성 및 음성대조

검체 존재하에서도 미생물을 검출할 능력이 있음을 확인한다. 시험결과에 영향을 주는 시험법의 변경이나 검체의 처방변경이 있는 경우에는 다시 적합성을 확인한다.
가) 시험균의 조제 시험균은 표준화된 안정한 현탁액을 쓰거나 다음과 같은 방법으로 조제한다. 시험에 쓰는 미생물은 최초의 마스터시드로트 (master seed lot)로부터의 계대수가 5 회를 초과하지 않게 시드 로트 배양관리수법 (seed lot system)으로 관리한다.

① 호기성미생물 각 세균시험용 균주를 대두카제인소화액체배지 또는 대두카제인소화한천배지에서 각각 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 24 시간 배양한다. 칸디다알비칸스용의 시험균주는 사부로포도당한천배지 또는 사부로 포도당액체배지에서 각각 20 ~ 25 ℃에서 2 ~ 3 일간 배양한다.
Staphylococcus aureus (황색포도구균) : 예를 들면 ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, NBRC 13276 또는 KCTC 1927
Pseudomonas aeruginosa (녹농균) : 예를 들면 ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275 또는 KCTC 2513
Escherichia coli (대장균) : 예를 들면 ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126, NBRC 3972 또는 KCTC 2571
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium 또는 이와 동등한 것 (살모넬라) : 예를 들면 ATCC 14028
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony (살모넬라) : 예를 들면 NBRC 100797, NCTC 6017 또는 CIP 80.39
Candida albicans (칸디다알비칸스) : 예를 들면 ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 또는 NBRC 1594, KCTC 7965
시험균 현탁액의 조제는 pH 7.0 펩톤염화나트륨완충액 또는 pH 7.2 인산완충액을 쓴다. 현탁액은 2 시간 이내에 쓰며, 2 ~ 8 ℃에서 보존하는 경우에는 24 시간 이내에 쓴다.
② 클로스트리디아 예를 들면 ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) 또는 ATCC 19404 (NCTC 532 또는 CIP 79.3)와 같은 Clostridium sporogenes를 쓴다. 클로스트리디아 시험 균주를 강화 클로스트리디아배지 중에 접종하고 30 ~ 35 ℃에서 24 ~ 48 시간 혐기적 조건에서 배양한다.
Cl. Sporogenes의 영양형 세포의 신선현탁액을 조제하여 희석하는 대신에 아포현탁액을 접종균액으로 사용 할 수 있다. 아포현탁액은 보증된 기간 내에서는 2 ~ 8 ℃에서 보존할 수 있다.

나) 음성대조 시험조건을 확인하기 위해 검액 대신 사용한 희석액을 써서 음성대조시험을 한다. 미생물이 증식해서는 안된다. 음성대조는 5)항에 따른 검체시험 시에도 측정한다. 시험에 실패한 음성대조는 고찰한다.

다) 배지의 성능시험 시판배지는 배치마다 시험한다. 건조배지 또는 각 성분을 가지고 조제한 배지는 조제배치 마다 시험한다. 표 II-1의 내용과 같이 관련 배지에 대하여 적절한 특성을 확인한다.
증식촉진특성시험, 액체배지 적당한 배지의 일부에 적절한 미생물을 소량 (100 CFU 이하) 접종한다. 규정된 온도에서 배양하고 배양시간은 시험법에서 규정되어 있는 배양기간 중 최단시간 이내로 한다. 유효성이 확인된 배지 배치에서 이전에 시험하여 얻은 증식과 동등한 증식을 확인한다.
증식촉진특성시험, 고체배지 각 평판배지에 적당한 미생물을 소량 (100 CFU 이하) 접종하고 한천평판도말법으로 시험한다. 규정된 온도에서 배양하고 배양시간은 시험법에 규정되어 있는 배양기간 중 최단시간 이내로 한다. 유효성이 확인된 배지 배치에서 이전에 시험하여 얻은 증식과 동등한 증식을 확인한다.
증식억제특성시험, 액체 또는 고체배지 적당한 배지에 적절한 미생물을 적어도 100 CFU 접종한다. 규정된 온도에서 배양하고 배양시간은 시험법에 규정되어 있는 배양기간 중 최장시간 이상으로 한다. 시험균의 증식이 확인되지 않는다.
감별특성시험 각 평판배지에 적당한 미생물을 소량(100 CFU 이하) 접종하고 한천평판도말법으로 시험한다. 규정된 온도에서 배양하고 배양시간은 시험법에 규정되어 있는 배양기간의 범위 내로 한다. 집락의 형상과 감별반응은 유효성이 확인된 배지 배치에서 이전에 시험하여 얻은 것과 동등하다.
라) 시험법의 적합성 검체마다 4)항의 관련 항목에 기재되어 있는 대로 검액를 조제한다. 규정된 증균배지에 혼합할 때 각 시험균을 넣는다. 시험균은 개별적으로 접종한다. 접종한 시험액 중 100 CFU 이하에 해당하는 균수의 미생물을 쓴다. 4)항의 관련항목에 따라 시험한다. 다만 규정된 배양기간 중 최단시간으로 한다. 특정미생물은 4)항에 기재된 감별반응으로 검출되어야 한다. 검체의 항균활성이 인정되는 경우에는 시험방법의 변경이 필요하다 (｢생균수시험｣의 3) 마)③항 항균활성의 중화·제거 항 참조). 어떠한 특정검체에서 규정된 시험법으로 미생물에 대한 항균활성을 중화할 수 없는 경우에는 억제된 미생물이 그 검체 중에 존재하지 않는다고 간주해도 된다.

3) Growth promoting and Inhibitory Properties of the Media, Suitability of the Test and Negative Controls
The ability of the test to detect microorganisms in the presence of the product to be tested must be established. Suitability must be confirmed if a change in testing performance, or the product, which may affect the outcome of the test is introduced.

i) Preparation of test strains Use standardised stable suspensions of test strains or prepare as stated below. Seed lot culture maintenance techniques (seed-lot systems) are used so that the viable microorganisms used for inoculation are not more than 5 passages removed from the original master seed-lot.
① Aerobic microorganisms Grow each of the bacterial test strains separately in containers containing Fluid Soybean-Casein Digest Medium or on Soybean- Casein Digest Agar Medium at 30 - 35 °C for 18 – 24 hours. Grow the test strain for Candida albicans separately on Sabouraud Glucose Agar Medium or in Fluid Sabouraud Glucose Medium at 20 - 25 °C for 2 - 3 days.
Staphylococcus aureus such as ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, NBRC 13276 or KCTC 1927 Pseudomonas aeruginosa such as ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275 or KCTC 2513 Escherichia coli such as ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126, NBRC 3972 or KCTC 2571 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium such as ATCC 14028 or, as an alternative, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony such as NBRC 100797, NCTC 6017 or CIP 80.39, Candida albicans such as ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72, NBRC 1594 or KCTC 7965. Use Buffered Sodium Chloride-Peptone Solution (pH 7.0) or Phosphate Buffer (pH 7.2) to make test suspensions. Use the suspensions within 2 hours or within 24 hours if stored at 2 – 8 °C.
② Clostridia Use Clostridium sporogenes such as ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) or ATCC 19404 (NCTC 532 or CIP 79.3). Grow the clostridial test strain under an aerobic conditions in Reinforced Clostridial Medium at 30 – 35 °C for 24 – 48 hours. As an alternative to preparing and then diluting down a fresh suspension of vegetative cells of Cl. sporogenes, as table spore suspension is used for test inoculation. The stable spore suspension may be maintained at 2 – 8 °C for a validated period.

ii) Negative control To verify testing conditions a negative control is performed using the chosen diluents in place of the test preparation. There must be no growth of microorganisms. A negative control is also performed when testing the products as described under 3. A failed negative control required an investigation.

iii) Growth promotion and inhibitory properties of the media Test each batch of ready-prepared medium and each batch of medium prepared either from dehydrated medium or from ingredients. Verify suitable properties of relevant media as described in Table II-1.

Test for growth promoting properties, liquid media Inoculate a portion of the appropriate medium with a small number (not more than 100 CFU) of the appropriate microorganism. Incubate at the specified temperature for not more than the shortest period of time specified in the test. Clearly visible growth of the microorganism comparable to that previously obtained with a previously tested and approved batch of medium occurs.
Test for growth promoting properties, solid media Perform surface-spread method, inoculating each plate with a small number (not more than 100 CFU) of the appropriate microorganism. Incubate at the specified temperature for not more than the shortest period of time specified in the test. Growth of the microorganism comparable to that previously obtained with a previously tested and approved batch of medium occurs.

Test for inhibitory properties, liquid or solid media Inoculate the appropriate medium with at least 100 CFU of the appropriate microorganism. Incubate at the specified temperature for not less than the longest period of time specified in the test. No growth of the microorganism occurs.
Test for indicative properties Perform surface spread method, inoculating each plate with a small number (not more than 100 CFU) of the appropriate microorganism. Incubate at the specified temperature for a period of time within the range specified in the test. Colonies are comparable in appearance and indication reactions to those previously obtained with a previously tested and approved batch of medium.
iv) Suitability of the test method For each product to be tested perform sample preparation as described in the relevant paragraph in section 4). Add each test strain at the time of mixing, in the prescribed growth medium. Inoculate the test strains individually. Use a number of microorganisms equivalent to not more than 100 CFU in the inoculated test preparation. Perform the test as described in the relevant paragraph in section 4) using the shortest incubation period prescribed. The specified microorganisms must be detected with the indication reactions as described in section 4). Any antimicrobial activity of the product necessitates a modification of the test procedure [see 4) iv) ③ of Total viable aerobic count]. If for a given product the antimicrobial activity with respect to a microorganism for which testing is prescribed cannot be neutralised, then it is to be assumed that the inhibited microorganism will not be present in the product.

 

4) 검체의 시험

가) 담즙산저항성 그람음성균
① 검액 조제 및 전(前)배양 검체 1 g 이상을 달아 그 10 배 희석액을 ｢생균수시험｣에 따라 조제하며, 이 때 희석액으로는 대두카제인소화액체배지를 써서 섞은 다음 균을 소생시키기에 충분하나 증균을 촉진시키지 않는 적절한 시간 (보통 2 시간이며 5 시간 이내) 동안 20 ~ 25 ℃에서 배양한다.
② 부정시험 따로 규정되어 있지 않으면 ①항에서 조제한 검체 1 g에 해당하는 검액을 모젤장내세균증균액체배지에 접종한다. 30 ~ 35 ℃에서 24 ~ 48 시간 배양한 다음 바이올렛·레드·담즙산·포도당한천배지에 이식하고 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 24 시간 배양한다. 집락의 증식이 없으면 검체는 이 시험에 적합하다.

③ 정량시험
i) 선택배양 ①항에 기재되어 있는 조제액 및/또는 그 희석액으로 각각 검체의 0.1 g, 0.01 g, 0.001 g (또는 0.1 mL, 001 mL, 0.001 mL) 해당량을 적당량의 모젤장내세균증균액체배지에 접종한다. 30 ~ 35 ℃에서 24 ~ 48 시간 배양 한 다음 바이오렛·레드·담즙산·포도당 한천배지에 각 배양액을 이식하고 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 24 시간 배양한다.
ii) 판정 집락의 증식이 인정된 경우에는 양성으로 판정한다. 양성결과로 나타난 검체의 최소량과 음성결과로 나타난 최대량을 기재하고 표 II-2로부터 세균의 추정값을 구한다.

나) 대장균
① 검액의 조제 및 전배양 검체 1 g 이상을 취하여 ｢생균수시험｣에 따라 조제한 10 배 희석액 10 mL 혹은 검체 1 g 또는 1 mL에 해당하는 양을 적당량 (3) 라) 시험법의 적합성에서 결정)의 대두카제인소화액체배지에 접종하고 섞은 다음 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 24 시간 배양한다.
② 선택배양 용기를 흔들며 대두카제인소화액체배지의 1 mL를 맥콘키액체배지 100 mL에 넣는다. 42 ~ 44 ℃에서 24 ~ 48 시간 배양한 다음 맥콘키한천배지에 이식하고 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 72 시간 배양한다.
③ 판정 집락의 증식이 인정(맥콘키한천배지에서 유당분해균(乳糖分解菌)은 적색에서 거의 적색, 비분해균(非分解菌)은 흰색)될 때에는 양성으로 의심하고 동정시험으로 확인한다. 집락이 없거나 또는 동정시험에서 음성으로 판정될 때 검체는 이 시험에 적합하다.
다) 살모넬라
① 검액 조제 및 전배양 검체 10 g 또는 10 mL를 취하여 적당량 (3) 라) 시험법의 적합성에서 결정)의 대두카제인소화액체배지에 접종하고 섞은 다음 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 24 시간 배양한다.
② 선택배양 대두카제인소화액체배지 0.1 mL를 라파포트바시리아디스살모넬라 증균액체배지에 접종한다. 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 24 시간 배양한 다음 XLD 한천배지에 이식하고 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 48 시간 배양한다.
③ 판정 충분히 증식한 빨간색집락이 인정될 때에는 중심부에 흑점의 유무에 관계없이 양성으로 의심하고 동정시험으로 확인한다. 기재되어 있는 종류의 집락이 없거나 또는 동정시험에서 음성으로 판정될 때 검체는 이 시험에 적합하다.

라) 녹농균
① 검액조제 및 전배양 검체 1 g 이상을 취하고 ｢생균수시험｣에 따라 조제한 10 배 희석액 10 mL 혹은 검체 1 g 또는 1 mL에 해당하는 양을 적당량 (3) 라) 시험법의 적합성에서 결정)의 대두카제인소화액체배지에 접종하여 섞은 다음 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 24 시간 배양한다. 경피흡수패취를 시험할 때는 ｢생균수시험｣의 4) 마)①항에 기재한대로 조제하고 1 패취 해당량을 멸균멤브레인필터로 여과하고 이 멤브레인필터를 100 mL의 대두카제인소화액체배지 중에 넣는다.
② 선택배양 세트리미드한천배지에 이식하고 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 72 시간 배양한다.
③ 판정 집락의 증식이 인정될 때에는 양성으로 의심하고 동정시험으로 확인한다. 집락이 없거나 또는 동정시험에서 음성으로 판정될 때 검체는 이 시험에 적합하다.
마) 황색포도상구균
① 검액조제 및 전배양 검체 1 g 이상을 취하여 ｢생균수시험｣에 따라 조제한 10 배 희석액의 10 mL 혹은 1 g 또는 1 mL에 해당하는 양을 적당량 (3) 라) 시험법의 적합성에서 결정)의 대두카제인소화액체배지에 접종하여 섞은 다음 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 24 시간 배양한다. 경피흡수패취를 시험할 때는 ｢생균수시험｣의 4) 마)①항에 따라 조제한 1 패취 해당량을 멸균멤브레인필터로 여과하고 이 멤브레인필터를 100 mL의 대두카제인소화액체배지 중에 넣는다.
② 선택배양 만니톨염화나트륨한천배지에 이식하고 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 72 시간 배양한다.
③ 판정 노란색의 띠로 둘러싼 노란색 또는 흰색집락의 증식이 인정될 때 양성으로 의심하고 동정시험으로 확인한다. 위와 같은 종류의 집락이 없거나 또는 동정시험에서 음성으로 판정될 때 검체는 이 시험에 적합하다.

4) Testing of Products
i) Bile-tolerant gram-negative bacteria
① Sample preparation and pre-incubation Prepare a sample using a 1 in 10 dilution of not less than 1 g of the product to be examined as described in Ⅰ. Total viable aerobic count, but using Fluid Soybean-Casein Digest Medium as the chosen diluents, mix and incubate at 20 – 25 °C for a time sufficient to resuscitate the bacteria but not sufficient to encourage multiplication of the organisms (usually 2 but not more than 5 hours).
② Test for absence Unless otherwise prescribed use the volume corresponding to 1 g of the product, as prepared in 3.1.1. to inoculate Fluid Enterobacteria Enrichment Broth Mossel Medium. Incubate at 30 - 35 °C for 24 – 48 hours. Subculture on plates of VRB(Violet/Red/Bile) Agar with glucose. Incubate at 30 – 35 °C for 18 – 24 hours. The product complies with the test if there is no growth of colonies.
③ Quantitative test
(i) Selection and subculture Inoculate suitable quantities of Fluid Enterobacteria Enrichment Broth Mossel Medium with the preparation as described under ① and/or dilutions of it containing respectively 0.1 g, 0.01 g and 0.001 g (or 0.1mL, 0.01mL and 0.001mL) of the product to be examined. Incubate at 30 – 35 °C for 24 – 48 hours. Subculture each of the cultures on a plate of VRB(Violet/Red/Bile) Agar with glucose. Incubate at 30 - 35 °C for 18 – 24 hours.
(ii) Interpretation Growth of colonies constitutes a positive result. Note the smallest quantity of the product that gives a positive result and the largest quantity of the product that gives a negative result. Determine from Table II-2 the probable number of bacteria.

Table II-2 Interpretation of results

ii) Escherichia coli
① Sample preparation and pre-incubation Prepare a sample using a 1 in 10 dilution of not less than 1 g of the product to be examined as described in Ⅰ. Microbial Enumeration Tests and use 10mL or the quantity corresponding to 1 g or 1mL to inoculate a suitable amount (determined as described under 3) iv)) of Fluid Soybean-Casein Digest Medium, mix and incubate at 30 – 35 °C for 18 – 24 hours.
② Selection and subculture Shake the container, transfer 1mL of Fluid Soybean-Casein Digest medium to 100mL of Fluid MacConky Broth Meedium and incubate at 42 - 44 °C for 24 – 48 hours. Subculture on a plate of MacConkey Agar Medium at 30 – 35 °C for 18 – 72 hours.
③ Interpretation Growth of colonies indicates the possible presence of E.coli. This is confirmed by identification tests.

The product complies with the test if no colonies are present or if the identification tests are negative.
iii) Salmonella
① Sample preparation and pre-incubation Prepare the product to be examined as described in Ⅰ. Total viable aerobic count and use the quantity corresponding to not less than 10 g or 10mL to inoculate a suitable amount (determined as described under 3) iv)) of Fluid Soybean-Casein Digest Medium, mix and incubate at 30 - 35 °C for 18 – 24 hours.
② Selection and subculture Transfer 0.1mL of Fluid Soybean-Casein Digest Medium to 10mL of Fluid Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth Medium and incubate at 30 - 35 °C for 18 – 24 hours. Subculture on plates of XLD (Xylose-Lysine-Desoxycholate) Agar Medium. Incubate at 30 – 35 °C for 18 – 48 hours.
③ Interpretation The possible presence of Salmonella is indicated by the growth of well-developed, red colonies, with or without black center. This i s confirmed by identification tests. The product complies with the test if colonies of the types described are not present or if the confirmatory identification tests are negative.
iv) Pseudomonas aeruginosa
① Sample preparation and pre-incubation Prepare a sample using a 1 in 10 dilution of not less than 1 g of the product to be examined as described in Ⅰ. Total viable aerobic count and use 10mL or the quantity corresponding to 1 g or 1mL to inoculate a suitable amount (determined as described under 3) iv).) of Fluid Soybean-Casein Digest Medium and mix. When testing transdermal patches, filter the volume of sample corresponding to 1 patch of the preparation described in I. Total viable aerobic count (4) v) ①.) through a sterile filter membrane and place in 100mL of Fliuid Soybean-Casein Digest Medium. Incubate at 30 – 35 °C for 18 – 24 hours.
② Selection and subculture Subculture on a plate of Cetrimide Agar Medium and incubate at 30 – 35 °C for 18 – 72 hours.
③ Interpretation Growth of colonies of colonies indicates the possible presence of P.aeruginosa. This is confirmed by identification tests. The product complies with the test if colonies are not present or if the confirmatory identification tests are negative.

v) Staphylococcus aureus
① Sample preparation and pre-incubation Prepare a sample using a 1 in 10 dilution of nor less than 1 g of the product to be examined as described in I. Microbial Enumeration Tests and use 10mL or the quantity corresponding to 1 g or 1mL to inoculate a suitable amount (determined as described under 3) iv).) of Fluid Soybean- Casein Digest Medium and homogenize. When testing transdermal patches, filter the volume of sample corresponding to 1 patch of the preparation described in I. Total viable aerobic count (4) iv)①.) through a sterile filter membrane and place in 100mL of Fluid Soybean-Casein Digest Medium. Incubate at 30 – 35 °C for 18 – 24 hours.
② Selection and subculture Subculture on a plate if Mannitol Salt Agar Medium and incubate at 30 - 35 °C for 18 – 72 hours.
③ Interpretation The possible presence of S.aureus is indicated by the growth of yellow/white colonies surrounded by a yellow zone. This is confirmed by identification tests. The product complies with the test if colonies of the types described are not present or if the confirmatory identification tests are negative.

 

표 III 미생물한도시험 시험적용 범위 및 기준

1) 생균제제는 세균시험을 제외한다.
2) 특정미생물 : 대장균, 살모넬라, 녹농균, 황색포도상구균
3) 효능․효과에 “소독”이 명시된 품목