[대한약전/KP] 무균시험법 Sterility Test

무균시험법

Sterility Test

 

이 시험법은 무균이 요구되는 원료 또는 제제에 적용한다.
이 시험에 적합하다는 결과는 단지 이 시험조건에서 시험한 검체 중에 오염미생물이 검출되지 않았음을 의미한다.
미생물오염에 대한 예방조치 무균시험은 무균조건에서 시험한다. 따라서 시험환경은 무균시험을 실시하는데 적합하여야 한다. 오염을 피하기 위한 예방조치는 이 시험으로 검출되는 어떠한 미생물에도 영향을 주어서는 안된다.
시험하는 작업영역은 적절한 샘플링과 적절한 관리로 정기적으로 모니터링 한다.

The test is applied to active pharmaceutical ingredients, preparations or articles which, according to the Pharmacopoeia, are required to be sterile. However, a satisfactory result only indicates that no contaminating microorganism has been found in the sample examined in the condition of the test.

 

미생물오염에 대한 예방조치 

무균시험은 무균조건에서 시험한다. 따라서 시험환경은 무균시험을 실시하는데 적합하여야 한다. 오염을 피하기 위한 예방조치는 이 시험으로 검출되는 어떠한 미생물에도 영향을 주어서는 안된다. 시험하는 작업영역은 적절한 샘플링과 적절한 관리로 정기적으로 모니터링 한다.

Precautions against microbial contamination 

The test for sterility is carried out under aseptic conditions. In order to achieve such conditions, the test environment has to be adapted to the way in which the sterility test is performed. The precautions taken to avoid contamination are such that they do not affect any microorganisms which are to be revealed in the test. The working conditions in which the tests are performed are monitored regularly by appropriate sampling of the working area and by carrying out appropriate controls.

 

검체의 무균시험

1) 일반요건 멤브레인필터법 또는 직접법으로 시험한다.
시험에는 적당한 음성대조를 쓴다. 멤브레인필터법은 여과 가능한 제품에 적용한다. 예를 들면 여과 가능한 수성, 알코올성 또는 유성의 제품 및 이 시험 조건에서 항균력이 없는 수성 또는 유성의 용제에 혼화 또는 용해하는 제품에 대해서 적용한다.

Test for sterility of the product to be examined
(1) General requirement
The test may be carried out using the technique of membrane filtration or by direct inoculation of the culture media with the product to be examined. Appropriate negative controls are included. The technique of membrane filtration is used whenever the nature of the product permits, that is, for filterable aqueous preparations, for alcoholic or oily preparations and for preparations miscible with or soluble in aqueous or oily solvents provided these solvents do not have an antimicrobial effect in the conditions of the test.

2) 멤브레인필터법 멤브레인필터는 미생물의 포집효율이 확립되어 있는 공경 0.45 μm 이하의 것을 쓴다. 예를 들면 셀룰로오스질산염 필터는 수용성, 유성, 저농도의 알코올성 용액에, 셀룰로오스아세테이트 필터는 고농도의 알코올성 용액에 쓴다. 항생물질과 같은 의약품에는 따로 적절한 필터가 필요한 경우도 있다.
다음에 제시한 방법은 지름 50 mm의 멤브레인필터를 사용한다고 가정한 방법이다. 만약 지름이 다른 필터를 쓰면 희석 및 세정액의 용량은 이에 따라 조정한다. 여과기나 멤브레인필터는 적절한 방법으로 멸균한다. 여과장치는 무균조건에서 검액을 도입하여 여과할 수 있으며, 멤브레인필터를 무균적으로 취하여 배지에 이식할 수 있고, 여과기 자체에 배지를 넣어서 배양하기에 적합하도록 설계되어야 한다.

(2) Membrane filtration
Use membrane filters having a nominal pore size not greater than 0.45μm whose effectiveness to retain micro- organisms has been established. Cellulose nitrate filters, for example, are used for aqueous, oily and weakly alcoholic solutions and cellulose acetate filters, for example, for strongly alcoholic solutions. Specially adapted filters may be needed for certain products, e.g., for antibiotics.
The technique described below assumes that membranes about 50 mm in diameter will be used. If filters of a different diameter are used the volumes of the dilutions and the washings should be adjusted accordingly. The filtration apparatus and membrane are sterilized by appropriate means. The apparatus is designed so that the solution to be examined can be introduced and filtered under aseptic conditions; it permits the aseptic removal of the membrane for transfer to the medium or it is suitable for carrying out the incubation after adding the medium to the apparatus itself.

가) 수성액제 1 g/L의 육제 또는 카제인제 펩톤용액 (pH 7.1 ± 0.2)과 같은 무균 희석액의 소량을 여과기 중의 멤브레인필터 위로 옮기고 여과한다. 예를 들면 항생물질이 시험대상일 때에는 희석액에 적당한 중화제나 불활화제를 넣을 수 있다.
필요하면 시험할 용기의 내용물을 측정법의 적합성시험에서 선택한 무균 희석액으로 희석한 다음, 표 2에 제시된 검체의 양 이상을 1 장 또는 복수의 멤브레인필터 위에 넣어 즉시 여과한다. 검체가 항균활성을 가지고 있을 때에는 측정법의 적합성시험에서 사용한 무균 희석액의 양으로 멤브레인필터를 3 회 이상 세정한다. 측정법의 적합성시험에서 항균활성을 충분히 제거되지 않은 것이 증명되어도, 멤브레인필터당 100 mL의 세정액으로 5 회 이상 세정하지 않는다. 멤브레인필터를 여과기로부터 꺼내어 반으로 절단하거나 미리 검액을 이등분하여, 각각에 대하여 동일한 여과조작을 하여 얻은 2 장의 멤브레인필터를 각각 배지에 넣는다. 각 배지의 양은 측정법의 적합성시험으로 확립된 양을 쓴다. 또는 멤브레인필터를 장착한 여과기 내에 검액을 이등분해 여과한 다음 각각에 배지를 넣는다. 배지를 14 일이상 배양한다.

나) 수용성 고형제 각 배지에 대하여 표 2에 규정된 양 이상을 쓴다. 첨부한 용제, 주사용수, 생리식염주사액 또는 1 g/L 육제 또는 카제인제 펩톤중성용액과 같은 적당한 용제에 녹이고, 선택한 용제에 적합한 멤브레인 필터를 써서 가) 수성액제 항에 따라 시험한다.
다) 기름 및 유성액제 각 배지에 대하여 표 2에 규정된 양 이상을 쓴다. 점도가 낮은 기름 및 유성액제는 희석시키지 않고 마른 멤브레인필터로 여과한다. 점조성 기름은 해당시험조건에서 항균성이 없는 것이 증명된 미리스틴산이소프로필과 같은 적절한 무균용제로 희석할 수 있다. 기름이 자체 무게로 멤브레인필터에 스며들게 한 다음 서서히 가압 또는 흡인하여 여과한다. 측정법의 적합성시험으로 적절하다고 증명된 농도의 적절한 유화제 (예를 들면 10 g/L 폴리소르베이트 80)를 함유하는 1 g/L 육제 또는 카제인제 펩톤중성용액과 같은 적당한 무균용액을 써서 멤브레인필터 당 약 100 mL 씩 적어도 3 회 세정한다. 가) 수성액제 항에 기재된 것과 같이 멤브레인필터를 배지에 넣거나 여과기에 배지를 넣어 같은 온도에서 같은 기간 배양한다.

라) 연고제 및 크림 각 배지에 대하여 표 2에 규정한 양 이상을 쓴다. 지방기제의 연고제나 유중수형의 유제는 위에 서술한 바와 같이 미리스틴산이소프로필로 1 %로 희석한다. 필요하면 40 ℃ 이하로 가온한다. 예외적으로 44 ℃ 이하까지의 가온이 필요한 것도 있다. 가능한 신속히 여과한 다음 다) 기름 및 유성액제 항에 따라 조작한다.

(i) Aqueous solutions: If appropriate, transfer a small quantity of a suitable, sterile diluents such as a 1 g/L neutral solution of meat or casein peptone pH 7.1 ± 0.2 onto the membrane in the apparatus and filter. The diluents may contain suitable neutralizing substances and/or appropriate inactivating substances for example in the case of antibiotics. Transfer the contents of the container or containers to be tested to the membrane or membranes, if necessary after diluting to the volume used in the method suitability test with the chosen sterile diluents but in any case using not less than the quantities of the product to be examined prescribed in Table 2. Filter immediately. If the product has antimicrobial properties, wash the membrane not less than three times by filtering through it each time the volume of the chosen sterile diluents used in the method suitability test. Do not exceed a washing cycle of 5 times 100 mL per filter, even if during method suitability it has been demonstrated that such a cycle does not fully eliminate the antimicrobial activity. Transfer the whole membrane to the culture medium or cut it aseptically into two equal parts and transfer one half to each of two suitable media. Use the same volume of each medium as in the method suitability test. Alternatively, transfer the medium onto the membrane in the apparatus. Incubate the media for not less than 14 days.

(ii) Soluble solids: Use for each medium not less than the quantity prescribed in Table 2 of the product dissolved in a suitable solvent such as the solvent provided with the preparation, water for injection, saline or a 1 g/L neutral solution of meat or casein peptone and proceed with the test as described above for aqueous solutions using a membrane appropriate to the chosen solvent.
(iii) Oils and oily solutions: Use for each medium not less than the quantity of the product prescribed in Table 2. Oils and oily solutions of sufficiently low viscosity may be filtered without dilution through a dry membrane. Viscous oils may be diluted as necessary with a suitable sterile diluents such as isopropyl myristate shown not to have antimicrobial activity in the conditions of the test. Allow the oil to penetrate the membrane by its own weight then filter, applying the pressure or suction gradually. Wash the membrane at least three times by filtering through it each time about 100 mL of a suitable sterile solution such as 1 g/L neutral meat or casein peptone containing a suitable emulsifying agent at a concentration shown to be appropriate in the method suitability of the test, for example polysorbate 80 at a concentration of 10 g/L. Transfer the membrane or membranes to the culture medium or media or vice versa as described above for aqueous solutions, and incubate at the same temperatures and for the same times.
(iv) Ointments and creams: Use for each medium not less than the quantities of the product prescribed in Table 2. Ointments in a fatty base and emulsions of the water-in-oil type may be diluted to 1 % in isopropyl myristate as described above, by heating, if necessary, to not more than 40 °C. In exceptional cases it may be necessary to heat to not more than 44 °C. Filter as rapidly as possible and proceed as described above for oils and oily solutions.

 

관찰과 결과의 판정

배양기간 중 및 최종일에 배지에서의 미생물의 증식유무를 육안으로 조사한다. 검체가 배지를 혼탁시켜 미생물증식의 유무를 육안으로 쉽게 판정할 수 없을 때에는 배양 시작일로부터 14 일 후에 해당 배지의 일부 (1 mL 이상)를 같은 배지의 새로운 용기에 이식하고, 본래의 배지와 이식시킨 배지를 4 일 이상 배양한다.
미생물의 증식이 관찰되지 않을 때 검체는 무균시험에 적합하다. 미생물의 증식이 관찰될 때에는 해당 검체와 관계없는 원인에 의하여 시험이 무효함을 명확하게 증명할 수 없는 한 검체는 무균시험에 적합하지 않다. 아래 조건 중 1 개 이상 해당될 경우 이 시험은 무효로 한다.
가) 무균시험시설의 미생물학적 모니터링 데이터에 문제가 나타난 경우
나) 무균시험 중에 쓴 시험방법을 조사한 결과 문제가 나타난 경우
다) 음성대조 중에 미생물의 증식이 나타난 경우
라) 해당 무균시험으로부터 분리된 미생물을 동정한 다음 그 균종의 증식이 무균시험 실시 중에 쓴 재료 및 용기 모두, 또는 어느 한 쪽에 문제가 있음이 명확히 판단되는 경우
시험이 무효인 것이 판명되면 최초 시험과 같은 수의 용기를 써서 재시험을 행한다. 재시험에서 미생물의 증식이 관찰되지 않을 때 검체는 무균시험에 적합하다. 재시험에서 미생물의 증식이 관찰될 경우에 검체는 무균시험에 적합하지 않다.

Observation and interpretation of results
At intervals during the incubation period and at its conclusion, examine the media for macroscopic evidence of microbial growth. If the material being tested renders the medium turbid so that the presence or absence of microbial growth cannot be readily determined by visual examination, 14 days after the beginning of incubation transfer portions (each not less than 1mL) of the medium to fresh vessels of the same medium and then incubate the original and transfer vessels for not less than 4 days.
If no evidence of microbial growth is found, the product to be examined complies with the test for sterility.

If evidence of microbial growth is found the product to be examined does not comply with the test for sterility, unless it can be clearly demonstrated that the test was invalid for causes unrelated to the product to be examined. The test may be considered invalid only if one or more of the following conditions are fulfilled:
(a) the data of the microbiological monitoring of the sterility testing facility show a fault;
(b) a review of the testing procedure used during the test in question reveals a fault;
(c) microbial growth is found in the negative controls;
(d) after determination of the identity of the microorganisms isolated from the test, the growth of this species or these species may be ascribed unequivocally to faults with respect to the material and/or the technique used in conducting the sterility test procedure.
If the test is declared to be invalid it is repeated with the same number of units as in the original test. If no evidence of microbial growth is found in the repeat test the product examined complies with the test for sterility. If microbial growth is found in the repeat test the product examined does not comply with the test for sterility.