[대한약전/KP] 액체크로마토그래프법 Liquid Chromatography

액체크로마토그래프법

Liquid Chromatography

 

액체크로마토그래프법은 적당한 고정상을 써서 만든 칼럼에 검체혼합물을 주입하고 이동상으로 액체를 써서 고정상에 대한 유지력의 차를 이용하여 각각의 성분으로 분리하여 분석하는 방법이다. 액상검체 또는 용액으로 만들 수 있는 검체에 적용할 수 있으며, 물질의 확인, 순도시험, 정량 등에 쓴다.
칼럼에 주입된 혼합물은 각 성분이 고유한 비율 k로 이동상 및 고정상에 분포한다.

이 비율 k는 액체크로마토그래프법에서는 질량분포비 k' 로 부른다. 이 비율 k, 이동상의 칼럼통과시간 t0 (k = 0인 물질을 주입한 때부터 그 물질의 피크정점까지의 시간) 및 유지시간 tR (피검검체를 주입한 때부터 피검물질의 피크정점까지의 시간)과의 사이에는 다음과 같은 관계가 있으므로 같은 조건인 경우 유지시간은 물질의 고유한 값이 된다.

Liquid Chromatography is a method to develop a mixture injected into a column prepared with a suitable stationary phase by passing a liquid as a mobile phase through the column, in order to separate the mixture into its components by making use of the difference of retention capacity against the stationary phase, and to determine the components. This method can be applied to a liquid or soluble sample, and is used for identification, purity test, and assay. A mixture injected into a column is distributed between the mobile phase and the stationary phase with a characteristic ratio (k) for each component.

The ratio k represents the mass distribution ratio(or the capacity factor) k' in liquid chromatography. Since the relation given below exists among the ratio (k), the time for which the mobile phase Is passed through the column (t0 : time measured from the time of injection of a compound with k=0 to the time of elution at the peak maximum), and the retention time (t0 : time measured from the time of injection of a compound to be determined to the time of elution at the peak maximum), the retention time for a compound on a column has a characteristic value under fixed chromatographic conditions.

 

장 치 

보통 이동상송액용펌프, 검체도입장치, 칼럼, 검출기 및 기록장치로 되어 있다. 필요하면 이동상조성제어 장치, 칼럼항온조, 반응시약송액용펌프, 화학반응조 등을 쓴다. 펌프는 칼럼 및 연결튜브로 이동상 및 반응시약을 일정한 유량으로 보낼 수 있는 것도 있다. 검체도입장치는 일정한 양의 검체를 정확하고 재현성이 좋게 장치에 도입하는 것이다. 칼럼은 일정한 크기의 액체크로마토그래프용충전제를 안쪽 면이 평활하고 불활성인 금속 등의 관에 고르게 충전한 것이다. 또한 충전제 대신 고정상을 관벽에 보유시킨 것을 쓸 수 있다. 검출기는 피검물질의 이동상과는 다른 성질을 검출하는 것으로 자외가시부흡광광도계, 형광광도계, 시차굴절계, 전기화학검출기, 화학발광검출기, 전기전도도검출기, 질량분석계 등이 있고 보통 수 μg 이하의 검체에 대하여 농도에 비례하는 신호를 낸다. 기록장치는 검출기에 의하여 얻어진 신호의 강도를 기록하는 것이다. 필요하면 기록장치로서 데이터처리장치를 써서 크로마토그램, 유지시간, 피검물질의 정량값 등을 기록 또는 출력할 수 있다. 이동상조성제어장치는 단계적 제어 (stepwise 방식)와 농도기울기제어 (gradient 방식)가
있고 이동상의 조성을 제어할 수 있다.

Apparatus
Basically, the apparatus required for the liquid chromatographic procedure consists of a pumping system for the mobile phase, a sample injection port, a column, a detector, and a recorder. A mobile phase component regulator, a thermostat for the column, a pumping system for reaction reagents and a chemical reaction chamber are also used, if necessary. The pumping system serves to deliver the mobile phase and the reagents into the column and connecting tube at a constant flow rate. The sample injection port is used to deliver a quantity of the sample to the apparatus with high reproducibility. The column is a tube with a smooth interior, made of inert metal, etc., in which a packing material for liquid chromatography is uniformly packed. A column with a stationary phase chemically bound on the inside wall instead of the column packed with the packing material may be used. The detector is used to detect a property of the samples which is different from that of the mobile phase, and may be an ultraviolet or visible spectrophotometer, fluorometric detector, differential refractometer, electrochemical detector, chemiluminescence detector, electric conductivity detector, mass spectrometer, etc. The output signal is usually proportional to the concentration of samples at amounts of less than a few μg. The recorder is used to record the output signals of the detector. As required, a data process or may be used as the recorder to record or output the chromatogram, retention times or amounts of the components. The mobile phase component regulator is used to vary the ratio of the mobile phase components in a step-wise or gradient fashion.

 

조 작 법

장치를 미리 조정한 다음 의약품각조에서 규정하는 조작조건의 검출기, 칼럼, 이동상을 써서 이동상을 규정하는 유량으로 흐르게 하고 칼럼을 규정온도로 평형이 되게 한 다음 의약품각조에서 규정하는 양의 검액 또는 표준액을 검체도입장치를 써서 검체도입부를 통하여 주입한다. 분리된 피검물질을 검출기로 검출하여 기록장치에서 크로마토그램을 얻는다. 분석되는 피검물질이 검출기에서 검출되는 데에 적합한 흡수, 형광 등의 물성을 갖지 않은 경우에는 적당하게 유도체화하여 검출한다. 유도체화는 보통 전라벨(prelabeling)법 또는 후라벨(postlabeling)법에 따른다.

Procedure
Fix the detector, column, and mobile phase to the apparatus, and adjust the flow rate and the column temperature to the values described in the operating conditions specified in the individual monograph. Inject a volume of the test solution or the standard solution specified in the individual monograph with the sample injector into the column through the sample injection port. The separated components are detected by the detector, and recorded by the recorder as a chromatogram. If the components to be analyzed have no readily detectable physical properties such as absorbance or fluorescence, the detection is achieved by changing the components to suitable derivatives. Usually, the derivatization is performed as a pre- or postcolumn labeling.

 

확인 및 순도시험 

이 방법을 확인시험에 사용하는 경우는 검액 및 표준액의 피검물질의 유지시간이 일치할 것 또는 검액에 표준피검물질을 첨가하여도 검체의 피검물질의 피크모양이 변하지 않을 때에 시험한다. 또한 피검물질의 화학구조에 관하여 동시에 알 수 있는 검출기를 이용할 경우, 유지시간의 일치와 화학구조에 관한 정보가 일치하는 것을 확인하는 것으로 보다 특이적인 확인시험을 수행 할 수 있게 된다. 이 방법을 순도시험에 사용하는 경우는 보통 검액 중 혼재물의 한도에 해당하는 농도의 표준액을 쓰는 방법 또는 면적백분율법으로 시험한다. 따로 규정이 없는 한 검액의 이성질체비는 면적백분율법으로 구한다. 면적백분율법은 크로마토그램에서 얻은 각 성분의 피크면적의 합계를 100으로 하고 이에 대한 각 성분의 피크 면적비로부터 조성비를 구한다. 다만 정확한 조성비를 얻기 위해서는 혼재물의 주성분에 대한 감도계수에 의해 피크면적을 보정한다.

Identification and purity test
When Liquid Chromatography is used for identification of a component of a sample is performed by confirming agreement of the retention time of the sample with that of an authentic specimen, or by confirming that the peak shape of the sample is unchanged after mixing the sample with an authentic specimen.
If a detector which is able to obtain chemical structural information of the component at the same time is used, more specific identification can be achieved by confirming identity of the chemical structure for the component and their retention times.
When this method is used for purity test, generally the purity of the sample is determined by comparing the test solution with the standard solution which is prepared by diluting the test solution to a concentration corresponding to the specified limit of the impurity, or by the peak area percentage method. Unless otherwise specified, if a sample is separated into isomers in the chromatogram, the isomer ratio is calculated by using the peak area percentage method.
The peak area percentage method is a method to calculate the proportion of the components from the ratio of the peak area of each component to the sum of the peak areas of every peak recorded in the chromatogram. In order to obtain accurate results in evaluating the proportion of the components, it is necessary to correct the area of each component based on the sensitivity factor to the principal component.

 

정 량 

1) 내부표준법 내부표준법에서 일반적으로 피검물질에 되도록 가까운 유지시간을 가지며 검체의 모든 피크와 완전하게 분리되는 안정한 물질을 내부표준물질로 선택한다. 의약품각조에서 규정하는 내부표준물질 일정량에 피검물질표준품을 단계적 농도가 되도록 넣어 여러 개의 표준액을 만든다. 이들 표준액 일정량씩을 주입하여 얻은 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크면적 또는 피크높이에 대한 피검물질표준품의 피크면적 또는 피크높이의 비를 구한다. 이 비를 세로축으로 하고 피검물질표준품의 양 또는 내부표준물질의 양에 대한 피검물질표준품의 양의 비를 가로축으로 하여 검량선을 작성한다. 이 검량선은 보통 원점을 지나는 직선이 된다. 다음에 의약품각조에서 규정하는 방법으로 같은 양의 내부표준물질을 넣은 검액을 만들어 검량선을 작성하였을 때와 같은 조건으로 크로마토그램을 얻어 그 내부표준물질의 피크면적 또는 피크높이에 대한 피검물질의 피크면적 또는 피크높이의 비를 구하여 검량선을 써서 검체의 양을 구한다. 의약품각조에서는 보통 검량선이 직선이 되는 농도범위에 들어가는 한 개의 표준액 및 표준액의 농도에 가까운 농도의 검액을 만들어 의약품각조에서 규정하는 각각의 양을 주입한 다음 같은 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 피검물질의 양을 구한다.

Assay

(1) Internal standard method In the internal standard method, choose a stable compound as an internal standard which shows a retention time close to that of the compound to be assayed, and whose peak is well separated from all other peaks in the chromatogram. Prepare several kinds of standard solutions containing a fixed amount of the internal standard and several graded amounts of the authentic specimen specified in the individual monograph. Based on the chromatogram obtained by injection of a fixed volume of individual standard solutions, calculate the ratio of peak area or peak height of the authentic specimen to that of the internal standard, and prepare a calibration curve by plotting these ratios on the ordinate against the amount of the authentic specimen or the ratio of the amount of the authentic specimen to that of the internal standard on the abscissa. The calibration curve is usually obtained as a straight line passing through the origin. Then, prepare a test solution containing the intermal standard in the same amount as in the standard solutions used for the preparation of the calibration curve according to the method specified in the individual monograph, perform the liquid chromatography under the same operating conditions as for the preparation of the calibration curve, calculate the ratio of the peak area or peak height of the objective compound to that of the internal standard, and read the amount of the compound from the calibration curve.

In an individual monograph, generally one of the standard solutions with a concentration within the linear range of the calibration curve and a test solution with a concentration close to that of the standard solution are prepared, and the chromatography is performed with these solutions under fixed conditions to determine the amount of the objective compound.

 

2) 절대검량선법 피검물질표준품을 단계적 농도가 되도록 취하여 여러 개의 표준액을 만들고 표준액 일정량씩을 정확하고 재현성 있게 주입하여 크로마토그램을 얻는다. 얻어진 크로마토그램으로부터 피검물질의 피크면적 또는 피크높이를 세로축으로 하고 피검물질표준품의 양을 가로축으로 하여 검량선을 작성한다. 이 검량선은 보통 원점을 지나는 직선이 된다. 다음에 의약품각조에서 규정하는 방법으로 검액을 만들어 검량선을 작성할 때와 같은 조건으로 크로마토그램을 얻어 피검물질의 피크면적 또는 피크높이를 측정하고 검량선을 써서 검체의 양을 구한다. 의약품각조에서는 보통 검량선이 직선이 되는 농도범위에 들어가는 한 개의 표준액 및 표준액의 농도에 가까운 농도의 검액을 만들어 의약품각조에서 규정하는 각각의 양을 주입한 다음 같은 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 피검물질의 양을 구한다. 이 방법은 주입조작 등의 모든 측정조작을 엄밀하게 일정한 조건을 유지하여 시험한다.

(2) Absolute calibration curve method Prepare standard solutions with several graded amounts of the authentic specimen, and inject accurately a fixed volume of these standard solutions. With the chromatogram obtained, prepare a calibration curve by plotting the peak areas or peak heights on the ordinate against the amount of the authentic specimen on the abscissa. The calibration curve is generally obtained as a straight line passing through the origin. Then, prepare a test solution according to the method specified in the individual monograph, perform the liquid chromatography under the same conditions as for the preparation of the calibration curve, measure the peak area or peak height of the objective compound, and read the amount of the compound from the calibration curve.

In an individual monograph, generally one of the standard solutions with a concentration within the linear range of the calibration curve and a test solution with a concentration close to that of the standard solution are prepared, and the chromatography is performed with these solutions under a fixed condition to obtain the amount of the component. In this method, all procedures, such as the injection procedure, must be carried out under a strictly constant condition.

 

피크측정법 기체크로마토그래프법의 피크측정법에 따른다.

Method for peak measurement 
The method for peak measurement under Gas Chromatography shall apply in the Liquid Chromatograpy. 

시스템적합성 기체크로마토그래프법의 시스템적합성에 따른다.

System suitability 
The System suitability under Gas Chromatography shall apply in the Liquid Chromatograpy. 

조작조건의 변경에 관한 주의사항 의약품각조의 조작조건 중에서 칼럼의 안지름 및 길이, 충전제의 입자경, 칼럼온도, 이동상의 조성비, 이동상의 완충액 조성, 이동상의 pH, 이동상의 이온쌍시약농도, 이동상의 염 농도, 이동상교체 횟수 및 시간, 농도기울기 프로그램 및 그 유량, 유도체화 시약의 조성 및 유량, 이동상의 유량과 반응시간 및 화학반응조 온도는 시스템적합성의 규정에 적합한 범위 내에서 일부 변경할 수 있다.

Point to consider on changing the operation conditions 
Among the operating conditions specified in the individual monograph, inside diameter and length of the column temperature, composition ratio of the mobile phase, pH of the mobile phase, composition of the buffer solutions in the mobile phase, concentration of ion pair-forming agents in the mobile phase, ionic strength of the mobile phase, numbers of condition changes, timing of such changes, gradient program, composition and flow rate of derivative-producing reagents, reaction time and temperature of reaction chamber and flow rate of mobile phase may be modified within limits which allow the required elution order, resolution, symmetry factor, and relative standard deviation to be obtained. 

용 어 기체크로마토그래프법의 용어에 따른다.

Terminology 
The definition of terms described under the Gas Chromatography shall apply in the Liquid Chromatography. 

주 의 

표준피검물질, 내부표준물질 및 시험에 쓰는 시약·시액은 측정을 방해하는 물질을 함유하지 않은 것을 쓴다.

Note 
Avoid the use of authentic specimens, internal standards, reagents or solvents containing substances that may interfere with the determination.